INCLUSÃO DE CONTROLE DE QUALIDADE AMOSTRAL PARA O APRIMORAMENTO DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA LEISHMANIOSE VISCERAL
Autor(es): Rômulo Pessoa e Silva, Lays Adrianne Mendonça Trajano-Silva, Suênia da Cunha Gonçalves-de-Albuquerque, Rayana Carla Silva de Morais, Cíntia Nascimento da Costa Oliveira , Sinval Pinto Brandão-Filho, Milena de Paiva-Cavalcanti |
| A leishmaniose visceral (LV) é uma grave doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. No ciclo da LV, homem e cão podem agir como reservatório/fonte de infecção para os insetos vetores. Portanto, o diagnóstico precoce e o constante monitoramento dos cães são de grande importância para o controle da patologia. Nesse contexto, a biologia molecular tem surgido como alternativa às limitações dos métodos convencionais, trazendo ferramentas como a PCR quantitativa em tempo real (qPCR), uma tecnologia de múltiplas possibilidades analíticas. No diagnóstico molecular, para reduzir chances de resultados errôneos, controles de qualidade amostral são utilizados, mas em reações separadas, gerando maior custo e tempo para emissão do resultado. O objetivo do estudo foi padronizar uma multiplex qPCR capaz de detectar simultaneamente pequenas quantidades do DNA de L. infantum e o gene constitutivo G3PD de mamíferos (controle endógeno). Utilizando o software Primer Quest, foram desenhadas duas sondas TaqMan adaptáveis aos sistemas LINF 1B e G3PD1, para detecção dos respectivos alvos. As concentrações de sonda e primers dos dois sistemas foram separadamente definidas a partir de testes preliminares, por análise do Ciclo threshold (Ct) e ΔRn. Após essa otimização individual, os sistemas foram testados em conjunto e o limite de detecção preliminar foi obtido. A análise in silico das sondas LINF 1B e G3PD1 demonstrou impossibilidade de anelamento com alvos inespecíficos. Foram escolhidas as concentrações de 3,0pmol/µL e 2,0pmol/µL de primers, e 0,5pmol/µL e 1,5pmol/µL de sonda para os sistemas G3PD1 e LINF 1B respectivamente. Limite de detecção alcançado: 100fg de DNA do parasito por reação (50µL). A multiplex qPCR foi padronizada. Espera-se, após a avaliação em amostras do novo protocolo, fornecer um diagnóstico mais acurado, rápido e com possibilidade de quantificação da carga parasitária em humanos e cães infectados, reduzindo os resultados falso-negativos e os custos na rotina laboratorial. |
