LAMP NA DETECÇÃO DE ISOLADOS BRASILEIROS DE TRYPANOSOMA VIVAX
Autor(es): Giuliana Nascimento dos Santos, Débora Lima Nascimento, Paulo Henrique Sampaio, Otávio Luiz Fidelis Junior, Patrícia de Athayde Barnabé, Marcos Rogério André, Rosangela Zacarias Machado, Adony Querubino de Andrade Neto, Carla Lopes de Mendonça, Nivaldo de Azevedo Costa, José Augusto Bastos Afonso, Fabiano Antonio Cadioli
LAMP NA DETECÇÃO DE ISOLADOS BRASILEIROS DE TRYPANOSOMA VIVAX
» Área de pesquisa: PROTOZOOLOGIA
» Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba/Unesp (FMVA)
» Agência de fomento e patrocinadores: FAPESP Proc. 14/04066-9
T. vivax causa anemia, emaciação progressiva e morte em equinos, bovinos e outras espécies de ruminantes. A fase crônica da doença é caracterizada por baixas parasitemias e aparasitemia, o que torna a detecção do T. vivax por meio de técnicas parasitológicas desafiador e tem contribuído para a dispersão da doença pelo Brasil. Técnicas moleculares como LAMP (amplificação isotérmica do DNA) são mais sensíveis na detecção do T. vivax. LAMP utiliza de quatro a seis primers que reconhecem de seis a oito regiões-alvo do DNA e baseia-se na atividade de polimerase Bst em temperaturas de 60 a 65°C, podendo ser realizada em locais com pouca infraestrutura, ao contrário do PCR convencional, além de ser muito mais sensível. O presente trabalho avaliou a técnica de LAMP na detecção de isolados brasileiros de T. vivax. Os primers testados provem do DNA satélite do T. vivax de isolados africanos. Foram testadas amostras de bovinos infectados naturalmente com os isolados “Lins” (n=10) e “Garanhuns” (n=5) de T. vivax com diagnóstico parasitológico positivo. A reação de LAMP foi realizada conforme descrita na literatura e o volume final da amostra ajustado para 25 uL com água destilada. Todas as reações foram conduzidas em duplicatas, acompanhadas de três controles negativos, um no qual não havia amostra de DNA e duas amostras de sangue de bovinos não-infectados com T. vivax. As reações ocorreram a 64°C/60 min., parada a 80°C/5 min e curva de dissociação com variação da temperatura de 63 a 96ºC com incrementos de 0,5ºC/5 s, utilizando termociclador CFX96 (BioRad, USA). Todas as amostras positivas no teste parasitológico (n=15) foram positivas também no LAMP, o que indica que o conjunto de primers testados, embora tenham sido desenvolvidos para isolados africanos de T. vivax, funcionam bem para isolados brasileiros, introduzindo assim uma nova ferramenta para o diagnóstico desta enfermidade.
