EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE RMS-3, UMA SERPINA DE RHIPICEPHALUS MICROPLUS
Autor(es): Marcela Scherer Barcellos, Marília Meneghel Colla Mattia, Rhayssa Marca Firpo, Lucas Tirloni, Gabriela Alves Sabadin, Itabajara da Silva Vaz Jr., Adriana Seixas
EXPRESSãO E PURIFICAçãO DE RMS-3, UMA SERPINA DE RHIPICEPHALUS MICROPLUS
» Área de pesquisa: ACAROLOGIA
» Instituição: Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre
» Agência de fomento e patrocinadores: CNPq, CAPES, INCT Entomologia Molecular, FAPERGS
As serpinas são inibidores de serino endopeptidases e formam uma superfamília de proteínas com papel em diversos processos fisiológicos. Como ectoparasitas hematófagos, os carrapatos produzem serpinas para modular os mecanismos de defesa do hospedeiro, possibilitando seu parasitismo. O objetivo deste trabalho foi expressar e purificar RmS-3, uma serpina recombinante de Rhipicephalus microplus na forma madura para posterior caracterização. A região codificante do gene da RmS-3 foi clonada em plasmídeo de expressão pET-43a e a proteína recombinante foi expressa em Escherichia coli (DE3) RIL na forma insolúvel. A expressão foi induzida com IPTG em uma concentração final de 1mM por 4 horas à 37ºC em meio Luria Bertani. As células foram lisadas por sonicação, centrifugadas a 17.300 g/10 min. Para obtenção da proteína solúvel purificada, a fração insolúvel foi submetida a uma sequência de lavagens, sendo a primeira com Triton-x 100 1%, seguido de três lavagens com Tris-HCl e a última com Guanidina 6 M. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e western-blot com anticorpos anti-histidina e anti-RmS-3. Uma proteína isolada de massa molecular referente à RmS-3 (43 kDa) foi observada no SDS-PAGE e reconhecida pelos anticorpos no Western Blot. A sequência desta proteína foi confirmada por espectrometria de massas. A proteína purificada está sendo utilizada para ensaios de caracterização de atividade inibitória utilizando diferentes serino endopeptidases.
