| Mutação no códon 200 do gene da β-tubulina tem sido associada com resistência aos benzimidazóis em alguns nematódeos. A PCR de amplificação refratária de mutação tem se mostrado sensível e específica para detecção dessa mutação, tornando-se ainda mais confiável, como qualquer outra técnica, quando utilizada com um controle positivo. Todavia, no caso dos ancilostomídeos a frequência alélica dessa mutação é baixa, o que dificulta o uso desse controle na reação. Assim, esse trabalho objetivou sintetizar um fragmento de DNA com a mutação desejada para servir como controle positivo no diagnóstico de resistência aos benzimidazóis em ancilostomídeos. Para tal, foi feita uma mutagênese sítio-dirigida através da técnica de Megaprimer PCR. Inicialmente, foi realizada uma primeira reação de PCR para aumentar a sensibilidade do teste, utilizando como molde DNA extraído de Ancylostoma caninum. Em uma segunda reação, foram utilizados dois novos iniciadores. Um dos iniciadores foi sintetizado com um nucleotídeo alterado em substituição ao nucleotídeo selvagem, mimetizando o polimorfismo de resistência. Essa segunda reação resultou em um produto de aproximadamente 150 pb. Esse produto foi então foi purificado e utilizado como um Megaprimer em uma terceira reação, que com outro primer foi responsável por amplificar um fragmento de 331 pb com a mutação desejada. Esse fragmento foi então clonado e submetido a sequenciamento para confirmação da alteração do nucleotídeo. Esse plasmídeo foi usado em uma reação de PCR utilizando tanto o iniciador desenhado para se anelar no alelo sem mutação, quanto outro iniciador desenhado para se anelar no alelo com a mutação. Só foi observada amplificação quando o primer para a mutação foi utilizado. Conclui-se, assim, que a técnica de Megaprimer-PCR constitui um bom método de mutagênese sítio-dirigida, permitindo a obtenção de um fragmento de DNA com a mutação desejada para uso como controle positivo na reação de Tetra Primer ARMS-PCR. |
